双荧光素酶报告基因检测试剂盒（高敏型）说明书

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产品详情

产品描述

报告基因检测常用于研究真核生物基因表达调控，萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶可以分别催化底物萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)发出生物萤光(bioluminescence)，这种发光反应具有良好的光学特征和浓度线性范围，同时检测的灵敏度高，可达到10-20mol。两种催化反应最适浓度不同，因此互不干扰，配合使用形成一套高灵敏的双荧光素酶报告基因检测系统，其中海肾萤光素酶常作为内参照。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61 kDa的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此过程中会产生发射波长560 nm的生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为36 kDa的蛋白，在氧气存在条件下，催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成coelenteramide，在此过程中会发出波长约为480 nm的生物萤光。在后加入海肾萤光素酶底物时，可有效淬灭萤火虫荧光素酶催化luciferin的发光，而不干扰海肾萤光素酶的活性，从而实现双萤光素酶报告基因检测。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或)或多功能酶标仪进行测定。通过萤光素酶与其底物催化发光的体系，可以高效、灵敏地检测目的基因的表达。

产品组分

使用方法

使用方法

1.试剂准备：

（1）1x Universal lysis Buffer配置：取所需体积的5x Universal lysis Buffer临用前用三蒸水稀释至1x用；

（2）Fluc buffer A工作液：试剂盒开启时，将Fluc buffer A全部加入到Fluc substrate中，适当吹打摇匀至粉末充分溶解后分装到棕色管中-20℃保存备用；

（3）Rluc Buffer B工作液：临用前取50x Rluc substrate用Rluc Buffer B稀释至1x用（按需配置），配置好的Rluc Buffer B工作液在2-3 h内使用有效。（试剂配置过程中注意避光）

2.细胞裂解物制备:

弃去培养板中的培养液，加入足量PBS清洗一遍，细胞刮刮取收集沉淀(如为悬浮细胞直接离心弃上清收集沉淀)。细胞沉淀可-80℃保存，也可立即加入适量1x Universal lysisBuffer吹打混匀，液氮冻融三次，制备细胞裂解物。

细胞裂解液推荐使用量：

3.萤光数值检测：

（1）荧光酶标仪设定，选择生物发光检测功能，根据本批样本的灵敏度选择合适增益与积分时间，默认为增益135，积分时间10 s。

（2）检测：

1)移液枪吸取细胞裂解液20 μL到黑色孔板底部（充分混匀裂解物）；

2)加入100 μL Fluc buffer A，移液器轻柔快速吹打混匀三次，立即启动检测，记录发光值（F值）；

3)加入100 μL Rluc buffer B，移液器轻柔快速吹打混匀三次，立即启动检测，记录发光值（R值）。（因手动控制检测会导致时间误差较大，对结果有一定的影响，建议配备计时器，保证不同样本之间反应和检测时长基本一致)

4.数据分析：

（1）实验设计：根据实验目的，每组实验均应设置空白对照组，对照组和处理组。

a.空白对照组

背景F：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景R：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白对照组样品量须与实验样品量相同，且与实验样品含有相同的培养基/血清组合。

b.对照组：转染细胞未经实验因素处理(即对照组F和对照组R)。

c.实验组：转染细胞经实验化合物处理(即实验组F和实验组R)。

计算结果：对照组比值=(对照组F-背景F)/(对照组R-背景R)，

实验组比值=(实验组F-背景F）/(实验组R-背景R)。

表达倍数=实验组比值/对照组比值。

图2.荧光素酶报告基因检测试剂盒操作示意图

实验案例分析

在六孔板中接种适量细胞过夜至贴壁状态，第二天用新鲜的空白培养基饥饿细胞4h后共转三个质粒：

1.含有法尼醇X受体（FXR）启动子区的荧光素酶报告基因表达载体质粒；

2.含有FXR启动子区转录因子E2功能区的表达载体质粒；

3.海参荧光素酶重组表达载体质粒。转染6h后更换为含有不同药物浓度的鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic acid，CDCA）和奥贝胆酸（Ocaliva，OCA）和Complete culture solution培养细胞48h，最后按试剂盒说明书操作刮收沉淀，随后立即裂解进行荧光素酶报告基因活性检测，结果如下:

图3（左）两个浓度（10μM，20μM）CDCA药物处理下，FXR启动子区荧光素酶报告基因激动倍数图；

（右）两个浓度（10μM，20μM）OCA药物处理下，FXR启动子区荧光素酶报告基因激动倍数图

（红色：起发生物品牌产品测定结果；黄色：进口“P"品牌产品测定结果）。

注意事项

（1）反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养液平衡至室温（20-25℃）。

（2）检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同。

检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光酶标板。

（3）发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响，应确保同组内不同样本检测条件一致。

（4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。

（5）本产品仅作科研用途！