线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1))说明书

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产品详情

产品描述

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)是利用JC-1作为膜电位识别的荧光探针，能够快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，用于早期的细胞凋亡检测。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。其检测原理为：当JC-1进入细胞后，正常细胞中线粒体膜电位较高，在此条件下JC-1会聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，进而产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1以单体存在，产生绿色荧光。实际使用过程中，我们通常通过比较红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的程度，方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变，可以很快速地捕捉到细胞膜电位的下降；同时红色到绿色荧光的转变，也可以作为细胞凋亡早期的一个检测指标。JC-1单体的最大激发波长为515nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。本试剂盒提供CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

产品组成

包装清单：

使用本试剂盒检测A549细胞在正常和造模前后的线粒体膜电位的效果图。正常A549细胞经JC-1染色后以聚合物形式存在，呈明亮的红色荧光，绿色荧光很弱；使用CCCP（10μM）诱导使线粒体膜电位下降后，JC-1以单体存在形式居多，因此线粒体内红色荧光强度显著降低，而绿色荧光显著增强。

运输与保存

-20℃避光保存，避免反复冻融。JC-1缓冲稀释液4℃保存，至少2周内有效。

实验步骤

1.JC-1染色工作液的配制：

取适量JC-1(200X)，按照每5µl+995μlJC-1缓冲稀释液（1X）的比例稀释至1XJC-1染色工作液。注：试剂盒标配JC-1缓冲稀释液为10X，使用前用三蒸水稀释至1X使用，配置前应于37℃水浴至室温后方可使用，以免稀释液过冷染色过程对细胞有刺激影响实验结果，稀释时将JC-1缓冲稀释液（1X）快速加入到200X的JC-1母液中稀释效果更佳。一般建议6孔板每孔使用JC-1染色工作液量为1ml，其它培养器皿用量以此类推。对于细胞悬液每5-10*106细胞加0.5mlJC-1染色工作液（1X）。

2.阳性对照组：

该试剂盒包含阳性对照CCCP（10mM），CCCP可以诱导细胞线粒体膜电位变化。使用方法：用细胞培养液配制CCCP，推荐终浓度为10µM，对于不同细胞CCCP浓度可自行调整。正常条件下，10µMCCCP处理20 分钟后线粒体的膜电位会明显改变，此时，JC-1染色后可观察到明显的绿色荧光；相反，正常的细胞经JC-1 染色后显示红色荧光。

3.悬浮细胞处置：

a)取5-10*106细胞，用0.5ml 细胞培养液重悬细胞。

b)加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。置于细胞培养箱中37℃孵育20-30分钟；不同细胞根据实验可自行调整染色时间。

b)孵育结束后，700g4℃离心，收取沉淀细胞。

c)用JC-1 缓冲稀释液（1X）洗涤2-3次：加入1ml JC-1 染色工作液重悬细胞，随后用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可用流式细胞仪分析。

4.贴壁细胞处置：

a)6孔板贴壁细胞处理过程如下：首先，弃培养液，用常温PBS或培养液轻洗细胞2次，加入1ml新鲜细胞培养液。阳性对照组中加入CCCP（终浓度10µM）提前置于孵箱中处理20-30分钟；

b)随后，加入1ml JC-1 染色工作液，充分混匀。置于培养箱中37℃孵育30-60分钟不等（可根据实验情况调整）。

d)孵育结束后，弃上清，用JC-1缓冲稀释液（1X）洗涤细胞2次。

e)加入1ml细胞培养液，于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5.纯化的线粒体：

a)1ml染色体系包含：0.9 mlJC-1染色工作液+0.1ml纯化的线粒体(10-100µg)；置于37℃孵育20-30分钟，期间可上下颠倒孵育液，使染色更加均一且充分。

b)孵育结束后，可用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：荧光分光光度计检测：激发波长为485nm，发射波长为590nm。荧光酶标仪检测时，激发波长可在475-520nm范围内设置。具体可参考步骤6中的条件进行荧光检测。

c)用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同步骤6。

6.荧光检测与数据分析：

JC-1单体的激发波为490nm，发射光波长为530nm；JC-1聚合物，激发波长为525nm，发射波长为

590nm。实际测试过程中，可依据实验室仪器的相关参数进行设置，不必把激发和发射波长设置在最大激发波长和最大发射波长。荧光显微镜或共聚焦观察时，JC-1单体的检测可参照其它绿色荧光时的设置，如GFP或FITC通道；同理，JC-1聚合物的检测时可以参考其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3的设置。因此，出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，我们可以通过比较红绿荧光的相对比例衡量线粒体膜电位的变化。

注意事项

8.注意事项：

a)JC-1探针母液（A 试液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；尽量减少反复冻融。

b)JC-1缓冲稀释液（B 试液）：如需无菌操作，使用前可用0.2μm滤膜过滤后装瓶使用即可。4℃保存，至少2周内有效。

c)CCCP（C 试液）：DMSO溶解，-20℃避光保存；尽量减少反复冻融。洗涤时也可以用Hanks'Balanced SaltSolution、PBS等替代JC-1缓冲稀释液。